ANEXT安龄生物 | 细胞外囊泡EVs的特性

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对于开发基于细胞外囊泡（EVs）的疗法，必须采用符合GMP的良好生产规范和质量控制（QC）生产临床级EV。适当的质量控制对于学术环境中的可重复研究也至关重要。最近，国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出了一系列细胞外囊泡研究的最小信息（MISEV），最终确定为MISEV2018。韩国食品药品安全部（MFDS）发布了世界上第一个EV治疗产品指南，名为《细胞外囊泡治疗产品的质量、非临床和临床评估指南》，这些指南中的大多数标准是相似的，并且已经在GMP环境中应用。常规质量控制标准包括确定EVs的数量、大小、特性和纯度。

EVs的数量和大小

MISEV2018和MFDS指南都建议至少使用两种不同的方法来确定EVs的数量。EVs的定量可以通过测量蛋白质、脂质或RNA的总量来实现，因为EV由所有这些分子组成。然而，这些方法不能提供有关EVs粒子数量的信息。有几种方法可用于测量颗粒的数量和大小，包括纳米颗粒跟踪分析（NTA），电阻脉冲传感（RPS）和动态光散射（DLS）。使用最广泛的方法是NTA，NTA通过跟踪水溶液中单个颗粒的布朗运动来确定颗粒的数量和大小。然而，NTA的多分散样品分辨率低，变异性大，例如装置间、检测间以及个体内和个体间变异。此外，NTA不会将EVs与其他纳米颗粒（如蛋白质聚集体）区分开来。最近，荧光NTA仪器已被引入，用于检测具有特异性抗体的荧光标记的EVs。然而，EVs的量化仍然极具挑战性。每年都有新技术和仪器被引入，特别是在ISEV会议期间，如纳米流式细胞术，直接随机光学重建显微镜，采用光盘技术的ExoCounter和成像流式细胞术。虽然开发完全兼容GMP的仪器需要一些时间，但EVs量化方法的巨大进步预计将在不久的将来克服当前的障碍。

EVs的特征

据报道，多种蛋白与EV有关，尤其是外泌体，包括四蛋白（CD9、CD63和CD81）、膜联蛋白、氟钛林、ALG-2相互作用蛋白X（Alix）和肿瘤易感基因101（TSG101）蛋白。推荐将CD9、CD63、CD81、TSG101和Alix等蛋白作为外泌体的特异性标志物，因为已知与原始细胞相比，外泌体高度富集。此外，由于Alix和TSG101参与MVB的形成，因此这些蛋白的存在对于支持外泌体的内吞起源至关重要。对于QC，建议至少使用半定量方法来检测外泌体中的这些蛋白质。酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术分析均适用于符合 GMP 标准的设施和一般学术实验室。尽管蛋白质印迹已在学术实验室中广泛使用，但由于缺乏适当的定量和方法验证，该方法受到限制。

EVs的纯度

EVs的纯度也是质量控制的关键标准。监测EVs纯度的一种简单方法是确定颗粒与蛋白质、蛋白质与脂质或RNA与颗粒的比例。缺乏细胞内蛋白，例如组蛋白、层粘连蛋白A/C、GRP94（即HSP90B1）、GM130（即GOLGA2）和细胞色素C（即CYC1），是确定EVs或外泌体纯度的另一个重要标准，因为这些蛋白质由于其严格的细胞定位而未富含外泌体。还应分析细胞培养过程中的杂质，包括抗生素和血清，以监测潜在有害物质的去除情况。每批EVs在用于治疗目的或功能测定之前都应通过常规质量控制，即使在学术实验室中也是如此，以确保可重复性。

效力测定

效力测定是预测EVs体内功效的最重要QC标准。美国食品药品监督管理局（FDA）等监管机构建议对细胞和基因治疗产品进行适当的效力测试]。MISEV2018和MFDS指南也推荐纳入EV QC的效力测定。效力定义为“通过适当的实验室检查或通过以预期方式给药产品获得的充分控制的临床数据所表明的产品的特定能力或能力，以达到给定的结果”。据报道，许多生物和生化检测证明了EVs或外泌体的效力。由于EVs的定量仍然具有挑战性，因此建立适当的效力测定将是监测批次间一致性和确定EVs剂量的宝贵工具。尽管理想的效力测定应代表MoA，但由于难以鉴定EVs复杂货物中的单一生物活性物质，因此很难通过单一生化或基于分离细胞的测定来建立适当的效力测定。例如，很难通过体外细胞测定来模拟体内复杂的免疫应答。